Detection of Helicobacter pylori in oral yeasts from students of a Chilean university

SUMMARY INTRODUCTION: Nearly 73% of the Chilean population is infected with Helicobacter pylori (H. pylori), a factor predisposing for gastric cancer. Recent studies have demonstrated the presence of this pathogen within yeasts, suggesting that this fact can directly influence the failure of a treatment, transmission, and reinfection. AIM: To detect the presence of H. pylori inside oral yeasts isolated from students of the University of Concepción (Chile). METHODS: 72 samples, obtained from the oral cavity using cotton swabs were incubated in YPD broth for 48h at 37°C and posteriorly seeded in Sabouraud Dextrose agar plus chloramphenicol at the same temperature and for the same time. Yeasts isolated were observed microscopically (wet mounting and Gram-stained) and identified using microbiological techniques. Intracellular H. pylori detection was performed by the amplification of 16S rDNA by PCR. RESULTS: Oral yeasts were detected in 24 samples (33.3%), being C. albicans (79.2%) the most frequent species, followed by C. dubliniensis (12.4%), C. krusei (4.2%), and C. tropicalis (4.2%). When analyzed by PCR, 15 of the 24 oral yeasts 62.5 % were positive for H. pylori 16S rDNA. From the 15 individuals positive for yeast harboring H. pylori, 81% of them reported stomach discomfort, and the presence of the bacteria was diagnosed at some moment in 20% of them. CONCLUSION: The intracellular presence of the H. pylori in oral yeasts suggests an endosymbiotic relationship of these microorganisms, which could favor H. pylori transmission and reinfection in the gastrointestinal tract.

RESUMO INTRODUÇÃO: Quase 73% da população chilena estão infectadas pelo Helicobacter pylori (H. pylori), fator predisponente ao câncer gástrico. Estudos recentes demonstraram a presença desse patógeno em leveduras, sugerindo que esse fato pode influenciar diretamente a falha de um tratamento, transmissão e reinfecção. OBJETIVO: Detectar a presença de H. pylori em leveduras orais isoladas de estudantes da Universidade de Concepción (Chile). MÉTODOS: 72 amostras, obtidas da cavidade oral utilizando cotonetes, foram incubadas em caldo YPD por 48h a 37°C e posteriormente sementes em ágar Sabouraud Dextrose mais cloranfenicol na mesma temperatura e ao mesmo tempo. Leveduras isoladas foram observadas microscopicamente (montagem úmida e corada por Gram) e identificadas utilizando técnicas microbiológicas. A detecção intracelular de H. pylori foi realizada pela amplificação do 16S rDNA por PCR. RESULTADOS: Leveduras orais foram detectadas em 24 amostras (33,3%), sendo C. albicans (79,2%), a espécie mais frequente seguida por C. dubliniensis (12,4%), C. krusei (4,2%) e C. tropicalis (4,2 %) Quando analisadas por PCR, 15 das 24 leveduras orais 62,5% foram positivas para o H. pylori 16S rDNA. Dos 15 indivíduos positivos para leveduras que abrigam H. pylori, 81% deles relataram desconforto estomacal e a presença da bactéria foi diagnosticada em algum momento em 20% deles. CONCLUSÃO: A presença intracelular do H. pylori em leveduras orais sugere uma relação endossimbiótica desses microrganismos, o que poderia favorecer a transmissão e a reinfecção do H. pylori no trato gastrointestinal.

Vigilância da resistência a antibióticos contra o Helicobacter pylori na região do Biobío (Chile) em uma década / Antibiotic resistance surveillance of helicobacter pylori at the biobío region (chile) in a decade

ABSTRACT BACKGROUND: Helicobacter pylori infection in Chile remains as a public and private health-care system's challenge, with a prevalence of the infection over 70%. Nowadays, antibiotic treatment of the infection is mandatory to prevent the arising of severe associated diseases but failures in the eradication therapy mainly due to clarithromycin resistance has been observed worldwide and first line eradication therapy seems to be not effective anymore in several geographical areas. Thus, health-care systems are committed to maintain an epidemiological surveillance upon the evolution of the antibiotic resistance of this priority 2 pathogen. OBJECTIVE: This work reports a 10 years surveillance of the primary antibiotic resistance of H. pylori clinical isolates at the Biobío region-Chile, and the evolution of resistance toward amoxicillin, clarithromycin, levofloxacin, metronidazole, and tetracycline among the species. METHODS: H. pylori strains were investigated during the periods 2005-2007 (1435 patients analysed) and 2015-2017 (220 patients analysed) by inoculating a saline homogenate biopsy onto the surface of Columbia agar (Oxoid, Basingstoke, UK) - supplemented with 7% horse red blood cells plus DENT inhibitor (Oxoid, Basingstoke, UK) - following by incubation at 37ºC under 10% CO2 atmosphere for five days. Antibiotic resistance pattern of the isolates was assessed using the disk diffusion test in Müeller-Hinton agar supplemented with 7% horse red blood cells followed by incubation for further three days under 10% CO2 atmosphere. Statistical analysis was done using the SPSS v22 software and P values <0.05 were considered statistically significant. RESULTS: A total of 41% of 1435 patients were detected to be infected with H. pylori by bacteriological culture in 2005-2007 period, meanwhile 32.7% from 220 patients were also infected in 2015-2017 period. The clinical isolates of H. pylori are mostly susceptible to amoxicillin and tetracycline (both over 98% of strains), but less susceptible to levofloxacin in both periods analysed (over 79% of the strains). On the other hand, metronidazole continuous showing the highest score of resistant isolates (over 40% of resistant strains), although an 18% fewer resistant strains were observed in 2015-2017 period. Clarithromycin, the key antibiotic in eradication therapies, has an increased frequency of resistant strain isolated in the decade (22.5% in 2005-2007 and 29.2% in 2015-2017). Multidrug resistant strains (two, three and four antibiotics) were also detected in both periods with the highest scores for simultaneous resistance to clarithromycin-metronidazole (18%) and clarithromycin-metronidazole-levofloxacin (12.5%) resistant strains. According to gender, the isolates resistant to amoxicillin, clarithromycin and metronidazole were more frequent in female, with a specific increment in amoxicillin and clarithromycin resistance. CONCLUSION: The frequency of clarithromycin resistance (29.2%) detected in 2015-2017 suggests that conventional triple therapy is no longer effective in this region.

RESUMO CONTEXTO: A infecção por Helicobacter pylori no Chile permanece como um desafio do sistema de saúde público e privado, com prevalência da infecção acima de 70%. Hoje em dia, o tratamento antibiótico da infecção é obrigatório para prevenir o surgimento de graves doenças associadas, mas falhas na terapia de erradicação, principalmente devido à resistência à claritromicina, têm sido observadas em todo o mundo, e a terapia de erradicação de primeira linha parece não ser mais eficaz em várias áreas geográficas. Assim, os sistemas de saúde estão comprometidos em manter uma vigilância epidemiológica sobre a evolução da resistência aos antibióticos deste patógeno prioritário tipo 2. OBJETIVO: Este trabalho relata uma vigilância de 10 anos da resistência antibiótica primária de isolados clínicos de H. pylori na região do Biobío-Chile, e a evolução da resistência em relação à amoxicilina, claritromicina, levofloxacina, metronidazol e tetraciclina entre as espécies. MÉTODOS: As cepas de H. pylori foram investigadas durante os períodos 2005-2007 (1435 pacientes analisados) e 2015-2017 (220 pacientes analisados) inoculando uma biópsia de homogeneizado fisiológico na superfície do agar Columbia (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) - suplementado com 7% de glóbulos vermelhos do cavalo mais o inibidor de DENTE (Oxoid, Basingstoke, Reino Unido) - seguindo pela incubação em 37ºC a atmosfera de 10% de CO2 por cinco dias. O padrão de resistência aos antibióticos dos isolados foi avaliado utilizando-se o teste de difusão em disco em agar Müeller-Hinton suplementado com 7% de glóbulos vermelhos de cavalo seguidos de incubação por mais três dias a atmosfera de 10% de CO2. A análise estatística foi realizada utilizando-se o software SPSS V22 e os valores de P<0,5 foram considerados estatisticamente significantes. RESULTADOS: Um total de 41% dos 1435 pacientes foram detectados como contaminados por H. pylori pela cultura bacteriológica no período 2005-2007, ao mesmo tempo 32,7% de 220 pacientes foram contaminados igualmente no período 2015-2017. Os isolados clínicos de H. pylori são principalmente suscetíveis à amoxicilina e tetraciclina (tanto mais de 98% das cepas), mas menos suscetíveis à levofloxacina em ambos os períodos analisados (mais de 79% das cepas). Por outro lado, o metronidazol permaneceu mostrando a maior pontuação de resistentes isolados (mais de 40% de cepas resistentes), embora tenham sido observados 18% menos cepas resistentes no período de 2015-2017. A claritromicina, o antibiótico-chave em terapias de erradicação, tem uma frequência aumentada de cepa resistente isolada na década (22,5% em 2005-2007 e 29,2% em 2015-2017). Cepas multirresistentes (dois, três e quatro antibióticos) também foram detectadas em ambos os períodos com os maiores escores de resistência simultânea à claritromicina-metronidazol (18%) e claritromicina-metronidazol-levofloxacina (12,5%) cepas resistentes. De acordo com o sexo, os isolados resistentes à amoxicilina, claritromicina e metronidazol foram mais frequentes no sexo feminino, com incremento específico em amoxicilina e resistência à claritromicina. CONCLUSÃO: A frequência de resistência à claritromicina (29,2%) detectada em 2015-2017 sugere que a terapia tripla convencional não é mais efetiva nesta região.

Relación entre el grado de contacto perro-propietario y la carga de helicobacterias en mucosa gástrica canina / Relationship between grade of contact dog-owner and the helicobacterias on gastric mucosa

Las helicobacterias son bacterias Gram negativas de forma curva o helicoidal ampliamente distribuidas en estómago de humanos y de diversos animales, ya sea como microbiota normal o causante de patologías gastrointestinales. El objetivo del trabajo consistió en determinar la relación entre la presencia y carga de helicobacterias en caninos, con el grado de contacto con sus propietarios positivos a estas bacterias utilizando el test rápido de ureasa. Se utilizó una muestra de 31 perros sanos de la ciudad de Chillán, Chile, de los cuales por vía endoscópica se obtuvo biopsias de mucosa de fundus gástrico, los cuales se sometieron al test rápido de ureasa. Los propietarios de estos caninos eran todos positivos a helicobacterias, lo que fue determinado a través del mismo test. El noventa y siete porciento de las biopsias caninas fueron positivas a helicobacterias. El treinta y nueve por ciento de las biopsias que reaccionó positivamente al test de ureasa en menor tiempo, pertenecían a caninos cuyo grado de contacto con sus propietarios era muy cercano. Los resultados sugieren que las altas cargas de helicobacterias encontradas en los caninos podrían deberse al mayor grado de contacto que tienen estos animales con sus propietarios. Por ello, sería importante determinar, en futuros estudios, si estas mascotas pueden ser reservorio o fuente de transmisión para las personas o viceversa y las especies bacterianas involucradas.

Helicobacter, Gram negative bacterias are curved or helicoidal microorganisms, widely spread in the stomach of humans and several animals, found as normal microbiota or causing of gastrointestinal pathologies. The objective of the work consisted of determining the relation between the presence and loads of helicobacterias in canine, with the degree of contact with its positive owners proprietors to these bacteria using rapid urease test. A sample of 31 healthy dogs of the city of Chillán, Chile were used, from which gastric fungus biopsies were obtained by endoscopy. These biopsies were put under the Rapid Urease Test. The owner of these canines were all positive for helicobacteria, determined by means of the same test. Ninety sevent percent of the canine biopsies were positive for helicobacteria. Thirty nine percent of the biopsies with the fastest positive reaction to the urease test belonged to canines with a high contact grade to their owners. The results suggest that the high charges of helicobacteria found in canines could be because of the higher contact grade of these animals with their owner. It would be important then to determine in future studies, whether if these pets could be a reserve or a transmission source for people, or viceverse, and the bacterial species involved.

Prevalencia de Helicobacter pylori y de genes asociados a virulencia en biopsias gástricas / Prevalence of Helicobacter pylori virulence genes in gastric biopsies in Chilean patients over a 10-year period

Introducción: La detección de genes asociados a virulencia en Helicobacter pylori constituye un buen marcadorgenético para predecir riesgo de enfermedades asociadas a la persistencia del patógeno. Objetivos: Determinar la prevalencia de cagA, vacA, babA2, iceA y dupA en pacientes chilenos, durante 10 años de seguimiento. Métodos: Se analizaron las biopsias gástricas de 1 577 pacientes (183 niños) obtenidas entre enero de 2003 y diciembre de 2007, mediante PCR convencional y cultivo bacteriano. En 374 individuos positivos se investigó la prevalencia de cagA, vacA (s1a, s1b, s2, m1, m2, i1 e i2), babA2, iceA (1 y 2) y dupA. Resultados: La prevalenciade H. pylori en adultos fue 48.7% y un 23.7% de los pacientes presentó más de un cepa bacteriana. La prevalenciapor genes fue: cagA 29.4%, vacAm1 52.7%, vacAm2 61.8%, vacAs1a 46.5%, vacAs1b 28.3%, vacAs2 41.7%, vacAi1 30.9%, vacAi2 12.0%, babA23.5%, iceA1 30.5%, iceA2 61.2% y dupA 28.9%. Se observó un 90% de concordancia en la prevalencia delos genes hpy, cagA, babA2, iceA e iceA2, y un 67.6% para vacAs1a, cuando se comparó biopsia y cultivo como fuente de ADN. Conclusiones: La mayoría de los genes de virulencia han mantenido su prevalencia en el tiempo,excepto vacAm1 y babA2 que la han aumentado. Sin embargo, la prevalencia de babA2 continúa siendo muy baja.

Background: Genes associated with virulence in Helicobacter pylori are good markers for prediction of risk of developing diseases due to persistent infection. Aim: To establish the prevalence of cagA, vacA, babA2,iceA and dupA among Chilean patients over a 10-year period. Methods: 1 577 gastric biopsies (183 children), collected from January 2003 to December 2007, were analyzed by conventional PCR and bacteriological culture. The prevalence of the genes cagA, vacA (s1a, s1b, s2, m1, m2, i1 and i2), babA2, iceA (1 and 2) and dupA were investigated in 374 positive individuals. Results: Prevalence of H. pylori in adults was 48.7%, with 23.7% of them presenting more than one infecting strain. Prevalence of genes was as follows: cagA 29.4%, vacAm152.7%, vacAm2 61.8%, vacAs1a 46.5%, vacAs1b 28.3%, vacAs2 41.7%, vacAi1 30.9%, vacAi2 12.0%, babA2 3.5%, iceA1 30.5%, iceA2 61.2% and dupA 28.9%. Ninety percent of agreement was observed in the prevalence of genes hpy, cagA, babA2, iceA and iceA2, by using DNA from both sources, but was only 67.6% for vacAs1a gene. Conclusion: The results suggest that all the genes conserved their prevalence in this period with the exception of vacAm1 and babA2, in which there was increased prevalence. Nonetheless, the prevalence of the gene babA2 continues to be very low.